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Virologie et Immunologie Moléculaires

Unité de Virologie et Immunologie Moléculaires

Interactions hôte - agent pathogène et immunité

Participants : Pierre Boudinot (responsable), Rosario Castro (Post doc), Bertrand Collet, Maxence Fréteau, Armel Houel, Luc Jouneau, Christelle Langevin, Sofie Navelsaker (thèse co-encadrée)

Mots-clés : Truite arc-en-ciel, Salmonidés, Poisson-zèbre, Infections virales et bactériennes, VSHV, virus de poissons, Infection, Immunité antivirale, Interférons, ISG, Etudes fonctionnelles et activité antivirale, Génomique des interactions virus-hôtes, Transcriptome, Imagerie, protéines TRIM, Immunité adaptative, Répertoires Ig et TCR, Modèles d'infections virales, Suivi de la réponse cellulaire et inflammatoire in vivo. 

   Réponse innée antivirale chez les Poissons : approches fonctionnelles

   La réponse antivirale non spécifique induite par différents virus (rhabdobvirus, birnavirus) est étudiée dans deux espèces « modèles » de poissons: la truite arc en ciel, salmonidé d’importance aquacole et le poisson zèbre, cyprinidé et espèce modèle en génomique, biologie du développement et immunologie.  Nos travaux visent à caractériser la réponse immunitaire innée chez les poissons et plus particulièrement la réponse IFN. Ces connaissances permettent d’envisager:le développement d’outils de diagnostiques pour les affections d’origine infectieuses chez les poissons et ont contribué au cours des dernières années à décrire l’évolution (la conservation et/ou la diversification) des mécanismes de défenses antivirales à travers les vertébrés.

   La réponse innée est étudiée par des méthodes d'analyse des transcriptomes, et complétée par des approches fonctionnelles ciblées qui conjuguent les avantages des deux espèces modèles. Les mécanismes d’action de gènes viro-induits sélectionnés (ISG15, finTRIM, vipérin) sont alors analysés in vitro et in vivo. L'évolution de la réponse: des IFN et des gènes viro-induits est étudiée par des approches de génomique comparée.

   La famille multigénique des protéines « TRIM » ou « RBCC » constitue un centre d’intérêt particulier de l'équipe, qui a découvert un groupe de TRIMs nommés "finTRIM” (fish novel TRIMs) très diversifiés (84 membres) et spécifique  des espèces  Poissons, ". Le rôle de ces protéines, en particulier dans les réponses antivirales, sont caractérisées en combinant des approches varies en modèles cellulaires et en larves de poisson zèbre.

   L'analyse de la réponse innée contre des bactéries pathogènes (en particulier F. psychrophilum) est conduite par des approches de transcriptome chez la truite. 

   Imagerie des réponses cellulaires et inflammatoires chez le poisson zèbre

   Le poisson zèbre constitue un modèle de choix pour l’étude dynamique des interactions hôte pathogène dans un organisme entier. Sa petite taille au stade larvaire aisni que sa transparence optique permettent de mener sur cette espèce, des approches d’imagerie dynamique à des resolutions cellulaires. Des modèles pertinents (lignées transgéniques) ont été développés pour suivre in vivo, les réponses immunitaires antivirales et les réponses inflammatoires suite à différents stimuli. Le laboratoire dispose donc de lignées transgéniques d’intérêt exprimant des protéines fluorescents dans différents sous types cellulaires (macrophages, neutrophiles, neurones, cellules épithéliales, …). Des methodes combinées d’imagerie en temps reel et d’imagerie sur tissus fixés sont conduites sur ces lignées à différents stades de développement.

 

 TEFOR© Nam Do Khoa©

 

 

 TEFOR© Nam Do Khoa©

 

 

    TEFOR© Nam Do Khoa©

 

   Les développements technologiques récents (transparisation) nous permettent d'analyser les réponses à des stades plus tardifs, quand le système immunitaire est complètement en place. 

 

Marquage tubuline acétylée sur une larve de poisson zèbre transparisée (stade 21dpf) : Collaboration S. Bolte, Institut de Biologie Paris-Seine 

 

   Les données sont analysées et quantifiées par des logiciels d’analyse d’images en collaboration avec la plateforme MIMA2 (rendu 3D) et Bioemergences (Tracking).

   Les équipements de la plateforme (micromanipulation, microinjection et stereomicroscopes) permettent également de conduire des experiences de perte et gain de fonctions par microinjection de morpholino et d’ARN.

   Analyse des réponses B et T induites par la vaccination chez les poissons

  La réponse adaptative induite par les vaccins, et les bases de la protection induite contre les infections, sont étudiées dans l'équipe en analysant la diversité des Anticorps et des Récepteurs de l'Antigène des cellules T, chez la truite arc en ciel. En particulier, le séquençage haut débit permet de décrire, à un niveau de détail sans précédent, la structure des répertoires B et T après immunisation ou infection. Ces approches permettent d'explorer les bases de la mémoire et de la protection induites par les vaccins chez les poissons. L'analyse comparative de ces données avec celles qui sont disponibles chez les mammifères donne aussi des clés pour comprendre l'évolution des réponses adaptatives. 

   Principaux projets et collaborations 

   Ces approches ont été développées gràce à de nombreuses collaborations. Les plus marquantes et durables comptent: l'équipe de JP Levraud (Institut Pasteur), de G Lutfalla (Univ Montpellier), de Chris Secombes (Univ Aberdeen, GB) et G Wiegertjes (Univ Wageningen, NL) pour les analyses fonctionnelles des ISGs et des IFN; l'équipe de JS Joly (CNRS), de S. Saulnier (Imagine), de N. Laguette (IGH, Montpellier), de V. Beringue (INRA) et de S. Bolte (Univ Paris 6) ainsi que l'ensemble du réseau TEFOR pour les projets d'imagerie du poisson zèbre; les équipes de A Six (Univ Paris 6), T Mora et A Walshak (ENS), F Cazals (INRIA), S Fillatreau (INEM) et O Sunyer (Univ Penn, USA), et plus récemment O Evensen (Univ Oslo, N), J Jorgensen (Univ Tromsö, N) et A Krasnov (NOFIMA, N)  pour les analyses de répertoires immunitaires; l'équipe de B Verrier (CNRS Lyon ) pour les stratégies de vaccination ARN.

   Agence Nationale de la recherche : Project Zebraflam (2011-2013). L'objectif de ce projet était de suivre en temps réel la propagation d'une infection virale dans un organisme vertébré entier, et d'observer simultanément le développement de la réponse de l'hôte, à une résolution où les cellules individuelles sont identifiables. Le rôle potentiel de ces molécules dans la modulation de la réponse inflammatoire pourra ainsi être établi. Les différents composants de la réponse de l'hôte - attraction des leucocytes, phagocytose, formation de granulomes, production de cytokines - seront suivis par microscopie en temps réel. Afin de compléter les études microscopiques, une analyse globale des variations du transcriptome induites lors de la phase précoce d'une infection virale a été effectuée, pour déterminer le rôle de la réponse aux IFNs, au TNfa et à l'IL-10.

   Agence Nationale de la recherche : Projet FishRNAVax  (2016-). L'objectif de ce projet est de tester l'efficacité de différents nanosystèmes biodégradables pour l'administration de vaccins aux poissons, en particulier par voie muqueuse (immersion par exemple). La distribution des nanoparticules est analysée chez le poisson zèbre par imagerie, et la réponse immunitaire est étudiée dans ce modèle ou par analyse des répertoires des Igs chez la truite arc en ciel. Une stratégie innovante de vaccins ARN est développée.

   European Projects Lifecycle PCRD7 2009-2013  & "Targetfish" PCRD7 (2012-2017) : La contribution du groupe à ces deux projets a été l'analyse de la structure des répertoires B et T de la truite arc en ciel par séquençage massif après différentes vaccinations suivant de multiples voies et protocoles. L'origine des réponses Ig publiques induites par la vaccination contre la Septicémie Hémorragique Virale a été analysée en détail. La diversité des TCR exprimée par des lymphocytes T présentant différents phénotypes définis par les récepteurs CD4 et CD8 a été caractérisée, donnat des indications sur les fonctions de ces cellules.

   European Project Vetbionet (Veterinary Biocontained research facility Network) (2017) : Ce projet vise à renforcer la coopération et l’accessibilité des plateformes d’infectiologie européennes, pour mieux connaître, contrôler et prévenir les maladies des animaux d’élevage. Ce projet intègre en particulier l'unité hébergeant les poissons à Jouy-en-Josas et fédère 30 partenaires issus de 14 pays. Outre les activités d’accueil et de soutien pour l’accès aux infrastructures d’infectiologie réparties dans les neuf pays européens partenaires, VetBioNet développe des activités de recherche qui concerne, pour l'équipe, le modèle poisson-zèbre.

   Fish for Pharma ITN PCRD7 (2012-2016) : La participation de l'équipe à ce consortium, associée au groupe de JP levraud à l'Institut Pasteur, a permis de développer des travaux sur les fonctions des finTRIM et des ISG, et d'établir un modèle d'infection du poisson zèbre par le virus neurotrope Sinbis, en identifiant la voie d'entrée dans le cerveau.

   Tefor "Infrastructures d'avenir" 2013-2018 : L'infrastructure TEFOR (Transgénèse pour les Etudes Fonctionnelles chez les ORgansimes modèles) (www.tefor.net) est une infrastructure distribuée qui soutient la recherche sur deux espèces modèles principales: le poisson zèbre et la drosophile. Ses principaux objectifs sont de fournir des services de transgenèse, de mutagenèse ou de phénotypage et de générer de nouvelles collections de lignées transgéniques, présentées dans des bases de données d'images 3D. L'unité VIM, partenaire de ce projet, est en charge du phénotypage des lignées de poisson zèbre d’intérêt pour l’étude du système immunitaire. La plateforme de phénotypage adosée à cette unite, est équipée de deux postes de microinjections et d’un microscope deux photons situé dans la zone pathogène des installations expérimentales poissons de l'IERP à Jouy-en-Josas. Au cours des dernières années, le laboratoire a contribué au développement de modèles d’infection virales chez le poisson zèbre (Novirhabdovirus, Alphavirus, …) et à la production de nouvelles lignées transgéniques d’intérêt pour l’étude de la réponse immunitaire anti virale. Les approches de phénotypage actuellement menées  à la plateforme reposent sur la mise au point de techniques innovantes d’immunomarquages (IHC in toto, transparisation) ainsi que sur le suivi de la dynamique des réponses immunitaires et inflammatoires par microscopie en temps réel (post infection ou immunization). Les développements technologiques ainsi que les analyses d’images sont menés en étroite collaboration avec les autres partenaires de l’infrastructure (TeforCoreFacility & Equipe CASBAH: Comparative Analysis of Stem cells, Brain Anatomy and Homeostasis (JS Joly), Bioémergences (N Peyrieras), CNRS Gif sur Yvette; plate-forme Amagen INRA/CNRS (F Sohm); et LPGP-INRA (V Thermes), INRA Rennes). 

   Contrat prestation/collaboration avec la compagnie L'Oréal 2014-2015-2016